注：

本文为中、日、英三种语言，下方附有中文翻译，供您查阅！

LPSには、骨代謝を促進する働きがあります。これまでの調査で、LPSを配合した飲料を摂取することで、骨密度の減少が抑制される結果が示されています（*1）。

骨密度維持のメカニズム

成团泛菌LPS维持绝经前女性的骨密度：一项随机、双盲、安慰剂对照试验

摘要

来自成团泛菌的LPSp可促进鸡颅骨和股骨中的钙和磷转换。本研究通过双盲临床试验研究了通过小鼠口服LPSp 预防骨质疏松症的效果。采用去卵巢（OVX）骨质疏松小鼠模型，我们研究了摄入含LPSp的水4周后对骨密度和Ca浓度的影响。口服LPSp有抑制OVX小鼠骨密度和皮质骨厚度下降的趋势。此外，OVX-LPSp 小鼠中的Ca浓度保持不变。 LPSp 对骨转换的影响，在随机和双盲临床受试者中进行了测试，这些受试者都是 40-79 岁的健康女性。受试者饮用不含 LPSp 的豆浆（对照组）或含有LPSp（LPSp 组）的豆浆持续3 个月。结果显示，与对照组绝经前和绝经后相比，绝经前LPSp组保持了骨密度。此外，这些效果在观察后维持了两个月。LPSp可维持体内骨体积和骨密度。因此，豆浆和LPSp的联合使用可能有助于预防骨质疏松症。

关键词：骨密度，LPS，骨质疏松症，绝经前，豆浆

引言

骨质疏松症是一种以骨密度低、骨质量差为特征的疾病，它会导致骨强度降低和骨折风险增加（Faienza et al. 2013）。这些骨折会导致老年人卧床不起（Hagino et al. 2006）。卧床不起的患者还可能患有痴呆症和肺炎，这可能会增加医疗费用，降低生活质量 (QOL)。因此，预防骨质疏松症对于降低医疗费用和提高生活质量非常重要，因为骨折后治疗无效。

骨量主要由成骨细胞（骨形成）和破骨细胞（骨吸收）调节（Lewiecki 2011）。骨骼是钙 (Ca) 的主要储存场所，也是钙稳态的关键调节器官。破骨细胞对钙维持的部分缺陷敏感，表达钙结合蛋白，并支持重要的Ca转运（Blair et al. 2011）。因此，成骨细胞和破骨细胞在调节骨量和钙代谢中发挥重要作用。骨质疏松症的预防和治疗需要钙（主要骨骼成分）和维生素D（钙吸收的促进剂）的摄入（Garriguet 2011）。然而，由于日本男性和女性的饮食偏好，钙摄入量通常不足。

此外，雌激素通过抑制免疫细胞产生破骨细胞因子，增加成骨细胞增殖，减少成骨细胞和骨细胞凋亡，诱导破骨细胞凋亡来促进骨形成（Krum 2011）。因此，绝经后女性由于雌激素分泌减少，绝经后妇女患骨质疏松症的风险增加。大豆异黄酮与雌激素有类似但微弱的作用，已知调节骨代谢（Yamaguchi 2006）。据报道，摄入钙和大豆异黄酮可预防骨质疏松症(Wong等，2009年；Alekel等，2010年；Verbrugge等，2012年），但它们不足以预防骨质疏松症。所以，开发预防骨质疏松症的新食物成分是非常重要的。因此，如果能够开发出一种基于异黄酮和钙以外的机制来调节正常骨代谢的安全食品，则可以利用它们的组合来预防骨质疏松症。开发预防骨质疏松症的新食品成分非常重要。因此，如果能够开发出一种基于异黄酮和钙以外的机制来调节正常骨代谢的安全食品，则可以利用它们的组合来预防骨质疏松症。

巨噬细胞通过预防感染、消除废物、愈合伤口和骨折以及调节骨代谢等代谢，在维持身体稳态中发挥作用（Stefater et al. 2011）。因此，活化的巨噬细胞可以防止骨结构随年龄增长而下降。我们在小麦粉的水提取物中鉴定出了巨噬细胞激活物质（Tsukioka et al. 1997）。这种激活物质是由革兰氏阴性共生菌成团泛菌产生的泛菌糖脂质（LPS）。成团泛菌存在于许多食用植物中（Asis 和 Adachi ，2004年；Miao 等人，2008年；Quecine 等人，2012年）并且是黑麦酵母发酵所必需的（Kariluoto 等人，2006年）。在欧洲，活的成团P. agglomerans 也被用作生物防治剂，以防止水果的真菌腐败（Kamber et al. 2012），它已被证实是一种安全的口服物质。成团 P. agglomerans LPS (LPSp)的作用已在动物和人体临床试验中得到报道，并已被证明可以改善糖尿病、血脂异常（Iguchi 等1992年；Okutomi 等1992年；Nakata 等2011年），和特应性皮炎，以及预防感染（Nakamoto et al. 2007年）和减轻疼痛（Okutomi等1992年 )。

此前，LPSp已被证明有促进离体鸡胚胎骨转换的潜力。据报道，LPSp促进了骨形成和骨吸收，因为LPSp增加了骨中的总Ca和磷(P)浓度（Kawashima et al. 1992）。因此，如果通过口服LPSp可以维持骨代谢和/或增加骨量，则有可能LPSp作为预防骨质疏松症的新机制。LPSp的作用机制可能与异黄酮不同，因为异黄酮通过与类似雌激素的雌激素受体结合来调节骨代谢（Yamagh 2006）。因此，LPSp与异黄酮之间可能存在协同作用。

在本项研究中，我们重点研究了LPSp及其联合异黄酮作为一种可能的安全食品调节正常的骨代谢，并可能与其联合可用于预防骨质疏松症。在之前的离体鸡胚实验的基础上，我们首先证实了口服LPSp对小鼠的作用。我们通过用LPSp喂养骨质疏松模型小鼠，发现LPSp对骨质疏松可能有预防作用。在此结果的基础上，我们还在一项随机双盲试验中研究了豆浆与LPSp（发酵面粉提取物）的组合，以确定它是否改善了40岁以上女性的骨浓度和新陈代谢。

结果

LPSp对骨质疏松模型小鼠作用的初步研究证实

我们使用 OVX 小鼠证实了摄入含有 LPSp 的发酵面粉提取物的效果。假手术或 OVX 小鼠可以自由饮用饮用水或发酵面粉提取物（LPSp 包括 0.05  μg /mL）4 周。我们测量了他们股骨的骨密度、钙浓度和皮质骨厚度。各组骨密度如下：SHAM-DW小鼠，537.0±2.5mg/cm 3； OVX-DW 小鼠，523.7 ± 6.1 mg/cm 3； OVX-LPSp 小鼠，541.6 ± 10.1 mg/cm 3。与SHAM-DW小鼠相比，OVX-DW小鼠的骨密度较低，而OVX-LPSp小鼠的骨密度高于OVX-DW小鼠。 OVX-LPSp 小鼠与 SHAM-DW 小鼠相似（图1A）。各组Ca浓度如下：SHAM-DW小鼠，1.10±0.04 mg/mm； OVX-DW 小鼠，1.01 ± 0.02 mg/mm； OVX-LPSp 小鼠，1.02 ± 0.04 mg/mm。 OVX-DW 和OVX-LPSp 小鼠的浓度低于 SHAM-DW 小鼠（图1B）。各组皮质骨厚度如下：SHAM-DW小鼠，0.175±0.005mm；OVX-DW 小鼠，0.171 ± 0.002 mm； OVX-LPSp 小鼠为 0.181 ± 0.004 mm。与 SHAM-DW 和 OVX-LPSp 小鼠相比，OVX-DW 小鼠的平均骨厚度较低。 OVX-LPSp 小鼠与 SHAM-DW 小鼠相似（图1C）。 OVX-LPSp小鼠骨密度呈增加趋势( P = 0.15）与 OVX-DW 相比。 OVX-DW 与 OVX-LPSp 小鼠的 Ca 浓度无显著差异，而 OVX-LPSp 小鼠的皮质骨厚度显著增加（P< 0.05）。因此，表明 OVX-LPSp 小鼠中总Ca含量增加。这些结果表明，LPSp 有助于预防骨质疏松症。

图 1.

骨质疏松模型小鼠摄入 LPSp 后，(A) 骨密度、(B) Ca 浓度和 (C) 皮质骨厚度发生变化。 OVX-LPSp小鼠摄入LPSp（0.05μg/mL -1 天-1）4周。分析股骨中的骨密度、钙浓度和皮质骨厚度。显示的是平均值+SE。*P<0.05。

研究人群的基线特征

我们研究了LPSp在使用或不使用发酵面粉提取物预防骨质疏松中的潜在应用。研究对象是 52名年龄在40-79岁之间的健康女性。52名女性中有4人因以下原因退出：临床检查日期不合适，担心服用期间扰乱月经。临床试验开始前受试者特征见表3。向22名受试者提供不含发酵面粉提取物组（对照）的豆浆，向26名受试者提供含有发酵面粉提取物组（LPSp组）的豆浆。对照组和 LPSp 组分别包含11名和10名绝经前妇女。各组的年龄分别为：绝经前对照（前对照）组44.9±3.8岁，绝经后对照（后对照）组58.0±4.9岁，LPSp前组45.4±2.8岁，LPSp 后组 58.0 ± 4.9 年。每组受试者的体重、脂肪、BMI 和骨密度相似。

表3.研究人群的基线特征

骨密度、骨碱性磷酸酶、NTx 和血清 Ca 的变化

在本研究中，忘记服用该产品的受试者不代表在摄入期。正常成人的骨密度约为1.0 g/cm 2。对照组在基线、+3个月和-2个月时的平均骨密度分别为0.62±0.10、0.61±0.10和0.61±0.10g/cm 2 (表4)。在LPSp组中，基线、+3个月和-2个月时的平均骨密度分别为0.60±0.12、0.59±0.12和0.59±0.12g/cm 2， 分别。在治疗组之间没有显著差异，因此我们比较了相对于基线的变化。结果显示，口服LPSp比对照组显着阻止了骨密度的下降，并且这种效果持续到-2个月：对照组在+3个月时，97.7±3.4%，在-2个月时，97.4±4.3 %; LPSp组在+3个月时为98.6±2.1%，在-2个月时为98.8±2.6%（表5）。我们还比较了绝经前组和绝经后组，LPSp 前组的平均骨密度维持在+3个月，即 99.1 ± 1.9%。然而，LPSp 治疗后+3 个月组的骨密度低于 0 个月，为 98.1 ± 2.3%。

表4.摄入LPSp后受试者身体成分和骨代谢标志物值的变化。

LPSp 组摄入 LPSp（0.6 毫克/天）。受试者摄入测试产品 3 个月，2 个月后不再摄入。医学评估进行了 3 次：0 个月为基线，+3 个月为基线后 3 个月的产品摄入期，-2 个月为 2 个月后不摄入产品的时期。所有数值均以平均值±标准差表示。

表 5.

摄入 LPSp 后受试者身体成分和骨代谢标志物的比例发生变化。

LPSp 组摄入 LPSp（0.6 毫克/天）。受试者摄入测试产品 3 个月，2 个月后不再摄入。进行了3次医疗评估； 0 m 是基线，+3 m 是从基线起 3 个月的产品摄入期，-2 个月是 2 个月后不摄入产品的时期。这些数据比较了相对于基线的变化。所有数值均以平均值±标准差表示。

骨代谢标志物包括BAP（成骨标志物）和NTx（骨吸收标志物）。 BAP是成骨细胞中大量存在的一种酶，它反映了成骨细胞的总数和潜在的成骨功能。 BAP 水平降低表明可能存在骨质流失。绝经前正常BAP值为2.9-14.5μg  / L，绝经后正常值为3.8-22.9μg  / L（表4）。结果显示，实验期间两组数值均正常。对照组的变化为：+3个月，102.0±15.2%； -2个月，110.0±13.8%，LPSp组的变化为：+3个月，106.3±17.0%； −2 个月，108.1 ± 18.2%（表5）。两组的 BAP 水平均呈上升趋势，但变化并不显著。绝经前组和绝经后组水平的比较显示，LPSp后组在+3个月时BAP水平显著升高，为107.4±17.5%，维持在-2个月时为109.7±18.1%。 NTx 是1型胶原蛋白交联 N-端肽的降解产物，1型胶原蛋白是骨中的主要蛋白质底物。已知NTx与骨退化有关。正常绝经前值为 7.5–16.5 NMBCE/L，绝经后值为 10.7–24.0 NMBCE/L。如果与正常绝经前女性相比，NTx水平超过平均值1.0 SD，则表明骨质流失的风险很高。各组基线值均高于正常绝经前值：对照组17.2±7.3 NMBCE/L，LPSp 组为 18.5 ± 6.5 NMBCE/L（表4 ).对照组NTx的变化为：+3个月，104.7±13.1%； -2 个月，104.5 ± 18.7%，LPSp 组为：+3 个月，101.9 ± 18.3%； −2个月，101.0±17.0%（表5）。对照前、对照后和LPSp前组NTx水平略有升高，而LPSp后组则有下降趋势，但各组间无显著性差异。我们还测量了与骨代谢相关的血清钙水平，对照组的结果为：基线，9.4±0.3 mg/dL；+3 个月，9.5 ± 0.3mg/dL； -2 个月，9.4 ± 0.4 mg/dL，LPSp 组为： 基线，9.4 ± 0.3 mg/dL；+3 个月，9.5 ± 0.4 mg/dL； −2 个月，9.4 ± 0.3 mg/dL（表4）。每组患者均较基线水平显着升高至 +3 个月（P  <  0.01）。然而，当治疗停止时，它恢复到与基线相同的水平。对照组和LPSp组之间没有显著差异。在绝经前和绝经后组中也获得了相同的结果。

月经和身体状况的影响

在服用期间月经周期没有发生任何变化的受试者包括对照组的4名女性和LPSp组的8名女性。

对照组的6名女性和 LPSp 组的10名女性经历了月经疼痛的变化这一组，虽然没有人经历过严重的月经疼痛。受试者的身体状况表明，他们的肠道运动受到影响，包括定期排便或腹泻。

讨论

在这项研究中，通通过测试在骨质疏松模型小鼠中摄入成团聚杆菌发酵面粉提取物的效果（进行人体试点研究），证实了LPSp可能用于预防骨质疏松。我们通过随机双盲临床研究调查了 LPSp 是否可以改善人类受试者的骨代谢。我们通过一项随机双盲临床研究调查了LPSp是否改善人类受试者的骨代谢。我们确认了足够的LPSp剂量（10–20μg/kg−1天−1通过口服摄入）从各种动物物种中对贝类、鱼类、小鸡、狗、小鼠和人类进行实验，以预防传染病、过敏性疾病和癌症等各种疾病（Kohchi 等人，2006年；Kadowaki 等人，2013 年））。一般来说，小鼠的平均体重为～25g，平均每日饮水量为～5mL。因此，将小鼠实验中的LPSp的摄取量设定为 10μg/kg-1/day-1。同样，在配制人体实验产品时，我们制作了含有60 μg LPSp 的测试产品，因为我们假设平均体重为 60 kg（10  μg kg -1 天-1LPSp）。事实上，本研究中LPSp的用量为11μg/kg-1day-1，因为LPSp组受试者的体重为54.4 ± 10.5 kg。这些剂量意味着与先前确定的剂量相等。

据报道，LPSp 在鸡顶骨和股骨离体培养实验中直接激活骨代谢（Kawashima et al. 1992）。用甲状旁腺激素 (PTH) 分离的鸡胎顶骨的钙释放到相似的水平。此外，LPSp 已被证明可以增加骨形成，而 PTH 则不能。在骨质疏松症模型小鼠中，摄入LPSp可有效预防OVX小鼠的骨质疏松症。虽然OVX-LPSp小鼠的Ca浓度没有显著差异（图1B），但皮质骨厚度却有显著增加（P  = 0.05）（图1C）。因此，LPSp摄入推断总Ca增加。此外， 与OVX-DW相比，OVX-LPSp小鼠的骨密度有增加的趋势（P =0.15）（图1A）。该结果并未显示出统计学上的显著差异，因为本研究表现出较大的方差。由于试点研究，我们使用了少量的小组。此外，我们使用了不同数量的动物，因为OVX组分配了大量动物，以尽量减少大方差对 OVX 操作的影响。虽然我们没有研究 LPSp + 异黄酮组，但我们的结果表明LPSp具有在低雌激素水平下维持骨转换的潜力，从而证实了口服LPS对骨的特定影响。

在临床研究中，LPSp组的骨密度保持不变，并且这种效果在治疗停止后仍保持2个月（表5）。将受试者分为绝经前组和绝经后组，绝经前女性的骨密度维持明显更好（表5）。然而，本临床研究中骨代谢标志物的水平并未反映这种效果（表5）。 LPSp后组骨密度下降，而早期BAP水平呈上升趋势（表5）。BAP水平与成骨细胞总数和潜在成骨功能相关。一般来说，骨代谢的研究需要6个月或数年，因为骨转换需要几个月的时间（Arjmandi等，2005年；Brink等，2008年；Wong等，2009年）。亚洲人饮用豆浆的3个月后，就显示出了阴道中间型细胞的增加和碱性磷酸酶倾向等生理改善的效果。然而，血清钙和骨骨密度没有变化（Uesugi et al. 2003）。因此，本研究中使用的观察期来检测某些生物标志物的变化是可能的，但骨标志物（BAP、NTx 和 Ca）仅3个月的治疗期可能不够。

虽然在lpsp前组观察到骨密度维持作用，而在lpsp后组没有（表5），但它可能受到雌激素的影响。雌激素诱导成骨细胞分化并促进骨形成（Beck and Hansen 2004）。然而，雌激素也通过直接诱导破骨细胞凋亡来抑制骨吸收（Kameda et al. 1997）。雌激素间接抑制白细胞介素（IL）-1b、IL-6、IL-7和肿瘤坏死因子的诱导——成骨细胞和骨髓基质细胞的分泌（Weitini2006；D‘Amelio等2011），同时增强消化道对钙的吸收。绝经后妇女的骨吸收增加，肠道钙吸收减少；因此，即使LPSp增强成骨细胞，也不可能在钙不足的情况下维持骨密度。为了阐明这一机制，我们将测量血清雌激素水平，探讨雌激素和LPSp可能的协同作用。

本研究中使用的豆浆含有30毫克的大豆异黄酮提取物。该含量低于日本食品安全委员会规定的建议每日最大摄入量（70-75 mg/day）的 50%（Branca2003；Coxam 2008）。豆浆中的异黄酮含量虽然不足，但可能弥补了本项研究中中老年女性雌激素水平下降的影响。

这些结果表明，LPSp有助于制定一些组合的骨质疏松症预防策略，因为LPSp与豆浆可有效维持绝经前女性的骨密度。

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