免疫系统中的巨噬细胞是一把双刃剑：既可抗击肿瘤，也可被肿瘤“教唆”助其生长扩散。此前，研究者发现了一个有趣现象：用低剂量的LPS“预训练”单核细胞，能使其在与结肠癌细胞相遇时保持“冷静”，抑制促癌基因的表达。这是否是一种普适性的抗癌机制？尤其在肝癌——这个具有独特免疫微环境的癌种中是否依然奏效？为解答这一问题，本研究深入探索了LPS处理的单核细胞与肝癌细胞相互作用后的基因表达谱。结果证实，这种“预训练”同样能有效“瓦解”肝癌的促瘤环境，关键信号基因的表达被广泛抑制。我们不仅看到了LPS在肝癌微环境下的“广谱”抗肿瘤潜力，更获得了一个可量化、可复用的体外共培养“沙盘”，为未来精准调控单核细胞、重塑肝癌免疫微环境提供全新坐标。本研究表明，通过先天免疫训练对抗肝癌的一种新视角，为开发基于单核细胞的免疫疗法提供了坚实理论基础。

LPS处理的人单核细胞与肝癌细胞相互作用后的基因表达研究

摘要

背景/目的：单核细胞迁移至组织后，分化为多种具有组织特异性特征的巨噬细胞。当人单核细胞与结肠癌细胞共培养时，其血管生成和信号通路相关基因的mRNA表达显著增加，这种增加可通过低剂量LPS预处理被抑制。因此，LPS处理的人单核细胞可能有助于抑制结肠癌中的肿瘤侵袭和增殖。但研究表明，肿瘤相关巨噬细胞的特性可能因癌症类型而异。目前人肿瘤相关巨噬细胞在肝癌中的功能尚不明确。本研究探讨了LPS处理的人单核细胞与肝癌细胞相互作用后各种基因的mRNA表达变化。

材料与方法：将人单核细胞系THP-1用LPS处理后，与人肝癌细胞系HepG2共培养。随后采用实时定量聚合酶链反应（PCR）和DNA微阵列分析各因子的mRNA表达水平。

结果：经LPS预处理后，THP-1细胞与HepG2细胞相互作用时，单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、血管内皮生长因子-A（VEGF-A）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-8、核因子-κB（NF-κB）、RelB、信号转导及转录激活因子3（STAT3）、IL-10和转化生长因子-β（TGF-β）等基因的mRNA表达均被抑制。

结论：经LPS预处理的人单核细胞可用于抑制肝癌和结肠癌的肿瘤侵袭和增殖，单核细胞和癌细胞的共培养系统可能有助于评估LPS处理的单核细胞的抗肿瘤作用。

单核细胞从骨髓释放到外周血，随后迁移至组织，并最终分化为具有组织特异性的各类巨噬细胞。巨噬细胞功能多样（1-4）：虽可通过诱导炎症反应清除癌细胞，但也可能因诱发慢性炎症而参与癌症的发展(5)。聚集在肿瘤组织中的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞（TAM）。

多项研究揭示了癌症患者预后与肿瘤相关巨噬细胞数量之间的关联。研究表明，高数量的肿瘤相关巨噬细胞与患者生存期缩短相关，但亦有证据显示出与良好预后相关。特别值得注意的是，这类巨噬细胞的高数量已被证实是多种癌症的独立预后因素（6-9），这表明人类肿瘤相关巨噬细胞的特性可能因癌症类型而异(9)。

已有研究表明，人单核细胞在与结肠癌细胞相互作用后，其趋化性和血管生成相关基因的mRNA表达水平显著升高（10,11）。另有研究表明，经低剂量LPS（100pg/ml）预处理后，这些基因在单核细胞中的mRNA表达增幅会受到抑制（12）。巨噬细胞通过核因子-ĸB（NF-ĸB）响应LPS信号传导(3)。研究发现，未磷酸化的信号转导及转录激活因子3（STAT3）通过与NF-ĸB结合激活启动转录过程，而活化的STAT3有助于维持癌细胞中NF-ĸB的活性（13,14）。此外，巨噬细胞产生的白细胞介素-10（IL-10）可通过Janus激活激酶（JAK）/STAT3依赖性通路抑制促炎细胞因子的生成（15-18）。因此，经LPS处理的单核细胞可能从促炎状态转变为抗炎状态（18）。在此背景下，我们研究了LPS预处理的人单核细胞在与结肠癌细胞相互作用后，信号通路激活与抑制相关基因的mRNA表达。结果表明，低剂量LPS（100 pg/ml）预处理可抑制这些基因的mRNA表达增加（19），从而可能抑制肿瘤进展。因此，LPS处理的人单核细胞可能有助于抑制结肠癌中的肿瘤侵袭和增殖。此外，既往研究已证实，小鼠皮内注射LPS对肿瘤生长具有显著抑制作用（20,21）。然而，人类肿瘤相关巨噬细胞在肝癌中的功能仍不明确。为阐明这一问题，本研究检测了LPS处理的人单核细胞在与肝癌细胞相互作用后，其趋化性、血管生成、信号通路激活与抑制相关基因的mRNA表达情况。

结果

用LPS处理的人单核细胞中趋化性和血管生成相关基因的mRNA表达。既往研究表明，与结肠癌细胞共培养后，人单核细胞中趋化性蛋白-1（MCP-1）、血管内皮生长因子-Α（VEGF-Α）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL- 1β和IL-8等趋化性和血管生成相关基因的mRNA表达水平升高。在与结肠癌细胞相互作用后，这些基因在人单核细胞中的mRNA表达也因低剂量LPS（100 pg/ml）预处理而受到抑制（12）。因此，我们研究了在与HepG2细胞共培养第5天，用LPS预处理的THP-1细胞中这些基因的mRNA表达。结果显示，在与HepG2细胞共培养第5天，用LPS（100 pg/ml、10 ng/ml和1μg/ml）预处理可抑制THP-1细胞中MCP-1、VEGF-A和IL-8的mRNA表达升高。在与HepG2细胞共培养第5天，用LPS（10 ng/ml和1μg/ml）预处理可抑制THP-1细胞中TNF-α和IL- 1β的mRNA表达升高（图1）。结果表明，LPS预处理能够抑制人单核细胞与肝癌细胞相互作用后趋化性与血管生成相关基因的mRNA表达。

图1.经LPS预处理的THP-1细胞中趋化因子及血管生成相关基因的mRNA表达水平。

LPS处理的人单核细胞中信号通路相关基因的mRNA表达。据报道，与结肠癌细胞相互作用后，人单核细胞中信号通路相关基因的mRNA表达被低剂量LPS（100 pg/ml）预处理所抑制（19）。因此，因此，我们检测了LPS预处理的THP-1细胞与HepG2细胞共培养第5天时NF-ĸB、RelB和STAT3的mRNA表达水平。结果显示，与HepG2共培养第5天，THP-1细胞经LPS（10 ng/ml及1 μg/ml）预处理后，NF-κB、RelB和STAT3的表达升高均被抑制（图2）。上述结果表明，用LPS预处理可抑制人单核细胞与肝癌细胞相互作用所引起的信号通路相关基因mRNA表达。

图2.经LPS预处理的THP-1细胞中信号通路激活相关基因的mRNA表达情况。

LPS处理的人单核细胞中，信号通路抑制相关基因的mRNA表达。已知巨噬细胞会产生IL-10，其通过JAK/STAT3依赖的途径抑制促炎细胞因子的产生（15-18）。因此，我们检测了在与HepG2细胞共培养第5天时，经LPS预处理的THP-1细胞中信号通路抑制相关基因的mRNA表达。结果显示：在与HepG2细胞共培养第5天时，LPS预处理（100 pg/ml、10 ng/ml和1 μg/ml）抑制了THP-1细胞中IL-10 mRNA表达的升高；同时，LPS预处理（10 ng/ml和1 μg/ml）也抑制了THP-1细胞中TGF-β mRNA表达的升高（图3）。这些结果表明，LPS预处理可抑制人类单核细胞在与肝癌细胞相互作用后，信号通路抑制相关基因的mRNA表达。

图3.经LPS预处理的THP-1细胞中信号通路抑制相关基因的mRNA表达水平。

通过DNA微阵列技术检测LPS处理的人单核细胞中mRNA表达水平。本研究采用DNA微阵列技术，系统分析了THP-1细胞与HepG2细胞共培养第5天时198个基因的表达变化。实验结果表明：当THP-1细胞与HepG2细胞相互作用后，CD86、CXCL6、干扰素（IFN）α5及Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）的mRNA表达量显著升高，而预先使用LPS预处理后（1 μg/ml），这些基因的表达水平被抑制至10倍以下（图4）。

图4.通过DNA微阵列技术分析经LPS预处理的THP-1细胞基因表达。

讨论

LPS是革兰氏阴性菌外膜的主要成分。已知LPS会触发促炎细胞因子的产生并引发急性休克反应。此外，LPS对多种实验性肿瘤具有显著的抗肿瘤作用（20）。既往研究证实，低剂量LPS预处理（100 pg/ml）可抑制人单核细胞与结肠癌细胞相互作用后趋化性、血管生成、信号通路激活及抑制相关基因mRNA表达的上调（12,19）。LPS处理的单核细胞可能从促炎状态转变为抗炎状态（18）。因此，我们研究了LPS处理的人单核细胞与肝癌细胞相互作用后这些基因的mRNA表达。结果显示：LPS预处理显著抑制了趋化性、血管生成、信号通路激活及抑制相关基因的mRNA表达。这表明尽管LPS对人单核细胞的有效浓度因癌症类型而异，但经LPS处理的人单核细胞对抑制肝癌和结肠癌的肿瘤侵袭与增殖可能具有重要价值。因此，LPS处理的人单核细胞有望成为肝癌治疗的新策略，单核细胞与癌细胞的共培养系统可能有助于评估LPS处理单核细胞的抗肿瘤效果。

DNA微阵列分析表明，经LPS（1 μg/ml）预处理后，人单核细胞与肝癌细胞相互作用引起的CD86、CXCL6、IFNα5和ZBP1的mRNA表达上调被抑制至不少10倍。近期研究还表明，T细胞共刺激分子CD86不仅参与T细胞活化，也具有T细胞抑制作用（23）。由此表明，LPS处理的单核细胞可能通过调节T细胞发挥抗肿瘤作用。此外，研究发现，虽然CXCL6是已知的趋化相关因子，但通过tetraspanin 12-β-连环蛋白通路上调CXCL6会增强肺癌细胞的侵袭与增殖能力（24）。最后，DNA微阵列分析中鉴定出的IFNα5和ZBP1参与干扰素生成。已有研究证实干扰素具有抑制肿瘤生长和抗肿瘤作用(25, 26)。因此表明，LPS处理的人单核细胞可有效抑制多种类型癌症中的肿瘤侵袭和增殖。研究结果还表明，LPS能在单核细胞中实现从促炎到抗炎功能的转换。

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