注：

本文为中、日、英三种语言，下方附有中文翻译，供您查阅！

Constipation and LPS

腸内細菌由来のLPSは腸の蠕動運動に関係することが報告されています。

ヒトの体の細胞数よりもはるかに多い数、100兆個もいると言われる腸内細菌ですが、このうち、少なくとも半数はLPSを持つグラム陰性細菌です。腸内のグラム陰性細菌から遊離するLPSが腸の筋肉マクロファージに作用すると、BMP2という物質を出して腸の神経細胞を刺激します（*1）。すると神経細胞は外筋層に蠕動を促します。こうして、腸内のLPSは腸の蠕動運動、つまり便秘の予防にも係っています。

腸内細菌のLPSは腸を蠕動させる

（*1）Crosstalk between Muscularis Macrophages and Enteric Neurons Regulates Gastrointestinal Motility, Cell 158: 300-313 (2014)

中文翻译：

据报道，来自肠道细菌的LPS泛菌糖脂质与肠道蠕动有关。

肠道中的细菌数量据说比人体细胞还要多，多达100万亿个，其中至少有一半是携带LPS的革兰氏阴性细菌。肠道革兰氏阴性细菌释放的LPS作用于肠道平滑肌细胞，通过产生一种名为BMP2的物质来刺激肠道神经元（*1）。这样，神经元会促进外层肌肉层的蠕动。因此，肠道中的LPS与肠道蠕动，即预防便秘有关。

肠道细菌的LPS能够促进肠道蠕动

( *1) cross talk between macrophages and enteric neurons regulates gastro intestinal motility，Cell 158: 300-313 (2014 )

以下内容为文献详情内容

肌层巨噬细胞和肠神经元之间的交流调节胃肠道动力

摘要

肠道蠕动是一个受饮食和微生物变化影响的动态生理过程。它受到复杂细胞相互作用的严密调控；然而，我们对这些控制的理解还不完整。肌肉巨噬细胞在肠道外肌层中分布。我们证明，在稳定状态下，肌肉巨噬细胞调节结肠的蠕动活性。它们通过分泌骨形态发生蛋白2（BMP2），激活肠神经元表达的BMP受体（BMPR）来改变平滑肌收缩的模式。肠神经元反过来分泌集落刺激因子1（CSF1），这是巨噬细胞发育所需的生长因子。最后，微生物群落的刺激通过巨噬细胞调节BMP2的表达和肠神经元的CSF1表达。我们的发现确定了一种可塑性、由微生物群驱动的肌肉巨噬细胞与肠神经元之间的交流，这种交流控制着胃肠道动力。

引言

肠道的蠕动对于推动摄入的物质通过胃肠道（GI）至关重要。这些运动是由形成肌肉外层的环形和纵向平滑肌的协调收缩和松弛产生的（图1A）。蠕动收缩的模式和频率由肠神经系统（ENS）和Cajal间质细胞（ICCs）局部调节。单核吞噬细胞，包括树突细胞（DCs）和巨噬细胞，构成了大多数组织中发现的异质性髓样细胞的异质性群体。它们的共同功能是通过清除和参与免疫反应来维持组织稳态（Hashimoto et al., 2011b）。在小鼠和人类的肠道肌肉中存在一个MHCII*巨噬细胞网络（Mikkelsen and Rumessen, 1992; Mikkelsen et al., 1985）。这个网络从胃延伸到远端结肠（Mikkelsen, 2010）。在肌肉层内，这些巨噬细胞主要积累在层间，位于浆膜和纵向肌之间，位于纵向和环形肌之间，以及外环和内环肌之间（Mikkelsen, 2010）。除了它们的吞噬特性（Mikkelsen et al., 1985），肌肉巨噬细胞（MMs）是强效抗原呈递细胞有时被称为树突细胞（DCs）（Flores-Langarica 等人，2005年）。

图1.MHCIICX3CR1 巨噬细胞（MMs）需要CSF1R信号来发育

与它们的黏膜对应物相比，肌肉巨噬细胞（MMs）的功能要少得多。一些研究表明，MMs与术后肠梗阻的发病机制有关，肠梗阻是一种短暂的胃肠道炎症状态，可导致肠麻痹（Mikkelsen，2010）。在手术操作的肠道区域，激活的MMs释放的炎症介质被认为通过直接影响平滑肌的收缩性以及通过招募额外的炎症细胞（Boeckstans和de Jonge，2009年；Wehner 等人，2007年）来损害肠道蠕动性。然而，MMs是否在调节构成性肠道生理中发挥作用，这一点尚未确定。受到这些细胞的独特分布的启发，以及由巨噬细胞是组织稳态的关键调节者这一观点的驱动（Chow 等人，2011年，2013年；Wynn 等人，2013年），我们假设MMs可能为平滑肌细胞提供营养支持，并通过这种支持调节构成性肠道蠕动。

为了测试我们的假设，我们开发了一个选择性短暂耗尽巨噬细胞（MMs）的模型。然后我们证明了巨噬细胞在稳定状态下调节肠道蠕动，并且确定了一种特定的因子BMP2，这种因子由巨噬细胞分泌，并通过直接作用于肠神经元而非平滑肌来调节肠道蠕动性。我们的工作揭示了MMs和肠神经元之间的相互交流。MMs通过提供BMP2支持肠内神经元，而神经元通过产生巨噬细胞特异性生长因子CSF1来促进MMs的稳态。最后，我们发现肠道微生物群发出的信号能够影响巨噬细胞和肠神经元之间的交流，并改变肠道蠕动性。

结果

MM发育需要CSF1受体信号传导

肠道是一个复杂的分层结构，包括黏膜、黏膜下层和肌层（图1A）。肠道黏膜由两种主要的单核吞噬细胞亚群（CD103+CD11bCX3CR1°树突细胞和CD103 CD11b CX3CR1*巨噬细胞）组成，每种细胞具有不同的发育途径和功能（Bogunovic等人，2009,2012）。关于MMs的表型和功能知之甚少，主要是因为这些细胞很难从肠道组织中分离出来。一种将肠道肌层从覆盖的黏膜和黏膜下层分离出来的技术使我们能够使用全膜层组织制备和单细胞悬浮液对MMs进行详细分析。(Bogunovic等人，2009年)。通过结合流式细胞术和免疫荧光分析，我们展示了巨噬细胞（MMs）代表了一群异质性的MHCII+CD11c+CD103+CD11b+细胞（Bogunovic等人，2009年），这些细胞表达高水平的CX3CR1（图1A-1C）。巨噬细胞群体类似于CD103+CD11b+CX3CR1+巨噬细胞，这些细胞位于肠道固有层（LP）（Bogunovic等人，2009年）。在肠道细胞的悬浮液中，巨噬细胞可以通过CD11c的低表达和MHCII的高表达与CD11c LP吞噬细胞轻松区分（Bogunovic等人，2009年；图S1A在线可查）。

FLT3和CSF1（也称为巨噬细胞集落刺激因子[M-CSF]）受体（CSF1R）是控制单核吞噬细胞发育的两个关键生长因子受体（Hashimoto等人，2011b）。我们之前已经证明CD103+CD11b+ LP巨噬细胞需要CSF1R信号来维持其稳态，并在Csf1r/-小鼠中减少（Bogunovic等人，2009年）。巨噬细胞与CD103+CD11b+ LP巨噬细胞之间的表型相似性促使我们研究CSF1R在巨噬细胞发育中的作用。我们发现巨噬细胞表达Csf1r（图1D），并且必须完全依赖于CSF1R信号，因为Csf1r/-小鼠缺乏这些细胞（图1E-1G）。此外，Csf1r/-骨髓（BM）祖细胞在移植到致死性辐射受体中时未能发育成巨噬细胞（图1H）。

为了研究巨噬细胞的功能，我们开发了一个模型，其中利用稳态特性选择性地耗尽巨噬细胞。我们发现巨噬细胞比LP吞噬细胞更依赖于CSF1R信号（图1G和1H），这为我们提供了一种策略，可以在不影响另一种细胞的情况下选择性地耗尽一种细胞。由于肠道中的CSF1R表达仅限于巨噬细胞和黏膜巨噬细胞（图S1B-S1D；小肠（SB）黏膜和黏膜下层[数据未显示]），单次腹腔内（i.p.）注射低剂量的阻断性抗CSF1R单克隆抗体（Sudo等人，1995年）（αCSF1R mAb）能够耗尽至少80%的巨噬细胞（图2A-2E，S2A和S2B），而不影响LP吞噬细胞（图2C，2D和S2B）或基质细胞（数据未显示）。巨噬细胞数量在抗体注射后24小时减少，并在7天后恢复正常（数据未显示）。在小肠和大肠（LB）（图2A-2E，S1C，S2A和S2B）中未观察到CSF1R水平在巨噬细胞或巨噬细胞耗尽效率上的差异。这种耗尽被认为是非炎症性的，因为在肌肉层或黏膜中没有淋巴细胞（图2F，S2C和S2D）、中性粒细胞或单核细胞（数据未显示）的募集。αCSF1R mAb的注射也没有增加肠道中的凋亡细胞数量（图S2E）。

综上所述，这些发现确定了CSF1R对巨噬细胞发育至关重要，并确立了体内阻断CSF1R作为这些细胞短暂耗尽的模型。

图2. 巨噬细胞（MM）耗尽的模型

MMs在稳定状态下调节胃肠道动力

在隔离的肠道中，可以通过向肠壁提供牵张力来引发蠕动反射（Frigo 和 Lecchini，1970年）。为了确定巨噬细胞（MMs）的条件性耗尽是否影响蠕动反射，我们开发了一种体外方法来记录对结肠环逐步牵张的蠕动收缩（图3A）。重复施加递增的牵张导致环立即收缩，随后逐渐放松，形成梯状的记录模式。增加的牵张产生了额外的高幅度收缩（进一步称为“牵张诱导收缩”），其幅度和频率逐渐增加（图3B）。在巨噬细胞耗尽的结肠环中，牵张诱导的收缩在较短的牵张时间内被引发，收缩更快，并且频率显著更高（图3B和3C）；因此信号的均方根值（rms）增加（图3C和3D）。尽管体外结肠过度活跃，但通过珠子排出试验测量的结肠通过时间在巨噬细胞耗尽后增加，可能是因为肌肉收缩协调性差且效率低（图3E）。在其他肠道动力参数中，胃排空加速，而从小肠和大肠的通过时间以及总肠道通过时间没有显著变化（图S2F-S2H）。如果胃排空加速和SB和LB动力的延迟相互抵消，就会发生这种情况，这表明整个肠道的动力受到巨噬细胞耗尽的影响。

为了进一步确认巨噬细胞在调节肠道动力中的作用，我们生成了具有Csf1r/-/-基因的嵌合体小鼠，这些小鼠具有Csf1r-/-基因的肝细胞来源的祖细胞。一些Csf1r/-基因嵌合小鼠明显发展出结肠通过时间的延迟（图S2I）；然而，Csf1r/-基因嵌合小鼠的嵌合不良和这些嵌合小鼠的低存活率不允许我们获得足够的动物进行统计比较。

总之，移除巨噬细胞导致运动障碍的观察表明，巨噬细胞有助于生理上调节肠道动力。

图3. 巨噬细胞（MMs）耗尽导致肠道运动障碍

MMs通过BMP2的产生调节肠道蠕动

这些发现引发了一个问题：巨噬细胞（MMs）是如何影响肠道动力的？

我们测试了最初的假设，即巨噬细胞分泌一种可溶性因子，这种因子会改变平滑肌的收缩性。为了识别编码潜在靶蛋白的基因，我们在不同的纯化肠道吞噬细胞亚群上进行了小鼠基因表达微阵列（Bogunovic等人，2009年，2012年），并进行了比较数据分析，以选择那些由巨噬细胞高度表达但与相关的CD103-CD11b+ LP巨噬细胞不表达的基因。骨形态发生蛋白2（BMP2）被确定为“前四名”中唯一一个非免疫基因，这些基因也编码了可溶性因子（Cd163、F13a1、Clec4e和Bmp2；图4A和4B）。没有其他BMP家族成员在任何肠道吞噬细胞亚群中表达（图4C和未显示的结果）。BMPs是转化生长因子β（TGF-b）超家族中的一组分泌蛋白，被认为主要控制器官发育（Hogan，1996年）。Bmp2-/-小鼠在胚胎期是致死的（Zhang和Bradley，1996年），而Bmp2+/-小鼠易受到低氧性肺动脉高压的影响，其特征是由于血管活性增加和结构重塑导致的肺动脉持续高压（Anderson等人，2010年）。BMP2在胎儿期（但不是成年期）肠道中高度表达，而BMP受体（BMPR）信号与肠平滑肌和神经元分化有关（Chalazonitis等人，2004年，2008年，2011年；Faure等人，2007年；Fu等人，2006年；Goldstein等人，2005年）。使用定量PCR（qPCR），我们确认了Bmp2在巨噬细胞中表达，但在纯化的肌肉淋巴细胞中不存在（图4D）。原位BMP2蛋白表达也仅限于MHCII+巨噬细胞（图4E）。为了检验BMP2是否在调节结肠动力中发挥作用，我们比较了体内用BMP受体信号抑制剂多索莫林（Yu等人，2008年）处理的小鼠和仅用载体处理的小鼠的结肠环牵张诱导收缩模式。dorsomorphin治疗引发了与巨噬细胞耗尽的小鼠结肠环中观察到的收缩过度活跃模式相似（图4F和S3A）。为了证实这种模式是由于BMP受体信号不足造成的，我们进行了一项“拯救”实验，在其中向巨噬细胞耗尽小鼠的结肠环中添加了递增浓度的外源性BMP2。BMP2以浓度依赖的方式减少了牵张诱导的收缩（图4G-4I）。当相同量的BMP2被添加到未耗尽巨噬细胞的结肠环中时，收缩性没有变化（图4G）。与我们的体外数据一致，BMP2注射部分加速了结肠转运时间（图4J）。

综合来看，我们的数据支持巨噬细胞分泌BMP2调节结肠收缩性的观点。

图4. 巨噬细胞（MMs）通过分泌BMP2调节肠道蠕动性

MMs激活表达BMPR受体的肠内神经元

我们接下来试图识别巨噬细胞（MMs）衍生的BMP2所靶向的细胞。平滑肌对外界刺激（牵张或钾离子电流（KCl））的收缩力在巨噬细胞耗尽后（图S3B和S3C）未受影响。CKit+ 肠间质细胞（ICC）和βIII型肌管蛋白+肠神经鞘（ENS）网络没有重叠（图S4A）。ICC和ENS网络在MP耗尽后仍然完整（图S5C和S3D），这表明急性巨噬细胞耗尽并不会在解剖学上破坏ICCs或ENS。上皮血清素+肠内分泌细胞的数量，这些细胞激活对腔内信号的蠕动反射（Bulbring和Crema，1959a, 1959b; Heredia等人，2013年），在注射αCSF1R单克隆抗体（mAb）后也未受影响（图S3E和S3F）。此外，即使在用最大剂量的αCSF1R mAb处理后，肠上皮的通透性仍然未受影响（图S3G和S3H）。我们评估了巨噬细胞和肠神经元之间的解剖学相互作用，发现绝大多数巨噬细胞沿着神经纤维定位，通常形成紧密接触（图5A）。BMP2通过I型和II型丝氨酸激酶（分别为BMPRIa和BMPRII）的寡聚化传递信号，这些激酶形成BMP受体（Kirsch等人，2000年）。我们发现BMPRII被βIII型肌管蛋白标记的神经元选择性表达（图5B），但不是ICCs（cKit+；图S4B）或与ENS相关的胶质细胞（GFAP+；图S4C），这表明巨噬细胞作用于肠神经元。配体结合到BMPR激活经典信号通路，通过SMAD1、5和8的磷酸化和核转位（Derynck和Zhang，2003年）。用重组BMP2处理培养的原代肠神经元，这些神经元表达BMPRa和BMPRII，但不是BMPRb和BMP2（图S4D），导致pSMAD1/5/8复合体在神经元核中的快速积累（图S4E）。此外，大多数BMPRII+肠神经元的核在体内呈pSMAD1/5/8阳性，证明通过BMPR的激活在持续发生（图S5C和5D）。相比之下，巨噬细胞耗尽导致体内大多数肠神经元的pSMAD1/5/8从核中消失，这与巨噬细胞对BMPR信号传递的关键贡献一致（图S5C和5D）。在缺乏巨噬细胞的肌肉层中加入外源性BMP2，恢复了具有pSMAD1/5/8未激活核的肠神经元数量接近正常水平（图S5C和5D）。

这些数据表明，巨噬细胞通过分泌BMP2为神经元提供持续信号，激活它们所表达的BMP受体。

图5. 巨噬细胞（MMs）激活肠神经元上的BMP2受体

肠内神经元产生巨噬细胞生长因子CSF1

CSF1和白细胞介素-34（IL-34）是激活CSF1R的两种替代配体（Lin等，2008；Yeung等，1987），这些细胞因子每一种都与不同巨噬细胞群体的发育有关（Greter等人，2012年；Hashimoto等人，2011b年；Wang等人，2012年）。巨噬细胞（MMs）不表达CSF1（图1A）或IL-34（数据未显示），这表明CSF1和IL-34必须由不同的细胞群体产生，可能是基质细胞。CSF1和IL-34由出生后大脑中成熟的神经元的不同亚型交替表达（Nandi等人，2012年）。因此，我们问题在于肠神经元和巨噬细胞之间是否存在额外的交流，其中肠神经元为巨噬细胞提供CSF1R配体。我们发现肠神经元在培养中表达CSF1，但不表达IL-34（图6A和6B），并且是肌肉层中CSF1蛋白的主要来源（图6C）。正如预期，并且与早期报告一致（Mikkelsen和Thuneberg，1999年），CSF1缺乏的Csf1op/op小鼠几乎完全缺乏巨噬细胞（图6D-6F）。

这些结果表明，肠神经元可能在维持巨噬细胞稳态中发挥关键作用。

Csf1op/op小鼠的骨缺陷，包括无牙（Wiktor-Jedrzejczak等人，1991年）以及它们显著较小的尺寸（图S5A），阻止了我们分析这些动物的肠道动力。然而，我们观察到，尽管Csf1op/op小鼠的肠道长度和直径都较小（小肠长度SB：WT的80%[Huynh等人，2009年]；大肠长度LB：WT的80%），这些动物的盲肠比WT小鼠大（图S5B），这表明Csf1op/op小鼠的肠道动力失调。

与我们使用短暂巨噬细胞耗尽模型获得的数据一致，我们发现与WT同胞相比，Csf1op/op小鼠结肠中的pSMAD1/5/8+肠神经元数量显著减少（图6G和S5C）。我们还观察到Csf1op/op小鼠肠神经元总数显著增加，同时ENS的组织结构不够有序（图6H和6I），这表明巨噬细胞在ENS发育中的重要性。这一观察与关于NS/E-noggin小鼠的先前发现相似，这些小鼠在神经元特异性酶（NSE）启动子的控制下过表达内源性BMP抑制剂noggin（Chalazonitis等人，2004年；Chalazonitis等人，2008年）。

图6 肠神经元产生MM发育所需的CSF1

肠腔微生物调节巨噬细胞-神经元交流

肠道微生物群似乎对于肠道蠕动的正常调节至关重要，而在无菌啮齿类动物（Abrams和Bishop，1967年；Gustafsson等人，1970年）以及TLR4-/-和Myd88-/-小鼠（Anita等人，2012年）中已经描述了严重的运动障碍。调节肠道蠕动的机制尚不清楚，可能涉及许多不同类型的细胞的异常。无菌、抗生素处理的TLR4-/-和Myd88-小鼠的肠道蠕动减慢伴随着肠神经元表型多样性的改变，以及氮能神经元数量的减少（Anitha等人，2012年）。巨噬细胞是否对这些调节过程有贡献尚不清楚。与已发表的报告类似（Abrams和Bishop，1967年；Anitha等人，2012年；Gustafsson等人，1970年），我们发现用广谱抗生素治疗的小鼠肠道蠕动严重紊乱（图7A、S6A和S6B）。巨结肠也发生在这些动物中（图S7E），因此，珠子排出试验对于测量结肠蠕动性没有价值。在进行体外分析时，我们发现抗生素治疗的小鼠结肠环显示出与巨噬细胞耗尽或多索莫林处理的小鼠结肠环相似的收缩过度活跃模式（图7B和S6C）。引人注目的是，我们发现与对照小鼠相比，抗生素治疗的小鼠Bmp2表达显著减少（图7C），这表明微生物群落影响巨噬细胞和肠神经元之间的相互作用。同样，与仅接受水的对照组小鼠相比，抗生素治疗的小鼠pSMAD1/5/8+肠神经元数量显著减少（图7D和S6D）。然后，我们质疑共生信号是否也可以调节肠神经元的CSF1产生。我们发现，向培养的原代肠神经元中添加泛菌糖脂质（LPS）增加了它们的Csf1表达（图7E），而在存在外源性BMP2的情况下培养原代肠神经元并不影响Csf1表达水平（数据未显示）。同样，体内抗生素治疗降低了结肠肌肉层中的Csf1表达（图7F），尽管Csf1减少的动力学缓慢，并在治疗4周后达到最低值（图S7A）。与Csf1减少一致，抗生素治疗也导致巨噬细胞数量减少（图7G、S7B和S7C），具有相似的动力学（图S7B）。在抗生素治疗过程中没有观察到黏膜巨噬细胞数量的减少（数据未显示）。此外，产生黏膜巨噬细胞（Bogunovic等人，2009年）和巨噬细胞（M.B.，未发表的数据）的Gr1hi血液单核细胞的数量没有受到影响，从而排除了对BM中髓系细胞发育的影响（图S7D）。

影响肠道蠕动的微生物群相关因素包括营养分解的组成部分、微生物代谢的副产品以及微生物细胞成分，如LPS（Reigstad和Kashyap，2013年）。虽然盲肠增大是抗生素治疗的早期迹象，但盲肠大小在治疗过程中持续增加（图S7E），这意味着各种微生物群相关因素以不同的动力学对抗生素诱导的运动障碍有贡献。Csf1表达和巨噬细胞数量的减少动力学与抗生素处理期间肠道腔细菌的减少相比有所延迟（图S7F），这表明在长期抗生素治疗后血清LPS减少（Anitha等人，2012年）可能是这些变化的原因。为了验证这一点，我们在维持抗生素的同时，按照之前描述的方法（Rakoff-Nahoum等人，2004年）在饮用水中补充了LPS。与体外数据和我们的假设一致，LPS补充防止了Csf1表达和巨噬细胞数量的减少（图7F、7G和S7C）。补充LPS也部分改善了胃肠道的转运时间（图7H），并减少了盲肠的大小（图S7G）。

图7. 肠腔微生物群调节肠道蠕动性和巨噬细胞-神经元交流 (A-D) 野生型（WT）小鼠饮用含抗生素的水4周，对照年龄匹配的小鼠仅饮用水。

接下来，我们询问巨噬细胞-神经元交流是否可逆。抗生素处理的小鼠通过从未经处理的对照小鼠进行粪便转移（FT）重新引入微生物群。恢复肠道腔细菌到接近正常水平（图S7H）能够恢复肠道中的Csf1表达（图7F）和巨噬细胞数量（图7G），并纠正运动障碍和盲肠大小（图7I）。

综合这些结果表明，巨噬细胞-神经元交流的两个组成部分的功能都可以通过腔内共生信号可逆地调节。

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